- reconhecer as proteínas como moléculas eletricamente carregadas
      - analisar a influência do pH sobre essas cargas
      - reconhecer os grupamentos responsáveis pela solubilidade das proteínas em água
      - identificar os agentes que podem alterar essa solubilidade

2. Introdução

      Vimos no experimento anterior que a solubilidade das proteínas em meio aquoso deve-se, em grande parte, à distribuição das cargas elétricas ao longo da molécula. Nesse sentido, se a interação proteína-proteína é grande e a interação proteína - água é pequena, a proteína tenderá a ser insolúvel.
Uma das maneiras de promover a precipitação de uma proteína é atingir seu ponto isoelétrico. Porém, existem outros fatores que influem de maneira importante nessa propriedade física das proteínas, como a ação de ácidos, bases, sais e solventes orgânicos. Além disso, podemos incluir a temperatura como um agente que pode ser utilizado para diminuir a solubilidade de uma proteína.
      Vamos lá:

3. Princípios teóricos e procedimento experimental

a) Precipitação de proteínas por adição de sais neutros (efeito da força iônica)

      Quando adicionamos sais neutros a uma solução, ocorre um aumento da força iônica do sistema. Assim, quando adicionamos pequenas quantidades de sal a uma solução contendo proteínas, as cargas provenientes da dissociação do sal passam a interagir com as moléculas protéicas, diminuindo a interação entre elas. Conseqüentemente, temos um aumento da solubilidade da proteína no meio aquoso. as interações proteína - proteína, favorecendo a solubilidade das mesmas. A esse fenômeno dá-se o nome de "salting-in". Esse efeito, porém, não se estende indefinidamente. Em condições de elevada força iônica, decorrente da adição de grandes quantidades de sal, temos o efeito contrário. O que acontece?
      Imagine uma solução aquosa de proteína à qual foi adicionada uma certa quantidade de sal neutro. A água, que apresenta um grande poder de solvatação, passa a interagir com as duas espécies: as proteínas e os íons provenientes da dissociação do sal. Porém, as moléculas de água apresentam maior tendência de solvatação de partículas menores (nesse caso, os íons). As moléculas de água, ocupadas em sua interação com os íons, "abandonam" a estrutura protéica. Como conseqüência, temos: maior interação proteína-proteína, diminuição da solubilidade em meio aquoso e, conseqüentemente, precipitação da proteína. A esse fenômeno de insolubilização da proteína em decorrência de um considerável aumento da força iônica do meio dá-se o nome de "salting-out".
      A precipitação de proteínas pela alta concentração de sais é um processo muito importante para a separação de misturas complexas de proteínas, uma vez que a concentração de sal necessária para precipitação é diferente para cada proteína.

      a.1. Material

      * Preparo da solução de clara de ovo: 1 volume de clara + 4 volumes de NaCl 1%

      ** Preparo da solução saturada de (NH₄)₂SO₄:7,7g do sal em 10 ml de água destilada

      a.2. Procedimento

1. Em um tubo de ensaio, colocar 2 ml da solução de proteínas;      2. adicionar, deixando escorrer pelas paredes do tubo, 2 ml da solução de sulfato de amônio;      3. observe.      4. Misture o conteúdo do tubo (por inversão) e anote os resultados.      5. Repita as etapas anteriores usando NaCl ao invés de (NH4)2SO4. O que você observou?

Veja as fotos desse experimento

b) Precipitação por sais de metais pesados e por ácidos fortes

      Os cátions de metais pesados como Hg²⁺, Pb²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Cd²⁺ e Zn²⁺ formam precipitados insolúveis de proteínas, denominados de acordo com o elemento formador (exemplo: proteinato de mercúrio, proteinato de chumbo, etc.). Essa precipitação é mais intensa quando o pH está acima do ponto isoelétrico (pI). Isso porque, acima do pI, a carga líquida sobre a proteína é negativa (ver determinação do ponto isoelétrico da caseína), favorecendo a interação com os cátions provenientes do sal.
      Então não é possível promover a precipitação de uma proteína abaixo do ponto isoelétrico?
      A resposta correta seria: não com sais... A precipitação abaixo do ponto isoelétrico pode ser feita, sim, mas através da adição de ácidos fortes.
      Comparando com o mecanismo anterior: quando a proteína está abaixo do seu pI, a carga líquida total da molécula é positiva. Isso facilita a interação da molécula com os ânions provenientes de ácidos como o tunguístico, o fosfotunguístico e pírico.
      Nas duas situações o precipitado pode ser ressolubilizado através de alterações do pH.

      b.1. Material

        b.2. Procedimento

a) Precipitação por sais de metais pesados       1. Em um tubo de ensaio, colocar 1ml da solução de proteínas;       2. adicionar 0,5 ml da solução de acetato de chumbo       3. adicionar 5 ml de água destilada;       4. observe e interprete os resultados.

Veja as fotos desse experimento

       b) Precipitação por ácidos

      Repita o procedimento anterior, substituindo a solução de acetato de chumbo pela solução de ácido tricloroacético a 10%.

c) Precipitação por ação do calor (desnaturação)

      As proteínas possuem uma estrutura tridimensional (conformação) bem definida, da qual dependem fundamentalmente suas propriedades físicas, químicas e biológicas. Essa estrutura é relativamente sensível à ação do calor, que causa desorganização das cadeias peptídicas, com conseqüente alteração conformacional. Esse fenômeno recebe o nome de desnaturação, e altera as estruturas quaternária, terciária e secundária da proteína sem afetar sua estrutura primária.
      A desnaturação promove alterações que diminuem a solubilidade da proteína, levando à sua precipitação. Essa precipitação é máxima no ponto isoelétrico da proteína e pode sofrer alterações pela adição de sais.

      c.1. Material

       c.2. Procedimento

1. Colocar 5 ml da solução de proteínas em um tubo de ensaio;       2. deixar o tubo em banho-maria fervente por 5 minutos (o tubo também pode ser aquecido direto na chama de um bico de Bunsen);       3. retire o tubo do banho, observe e anote os resultados.

Veja as fotos desse experimento

d) Precipitação das proteínas por solventes orgânicos

      A solubilidade das proteínas em solventes orgânicos é menor do que em água. Isso acontece porque a capacidade de interação com as partículas de soluto é diferente para cada solvente. A grandeza que mede a capacidade de interação do solvente com o soluto é denominada constante dielétrica. A água apresenta constante dielétrica bastante elevada (aproximadamente 80). Mas o que isso quer dizer?
      Vamos utilizar novamente a imaginação. Numa solução contendo, exclusivamente, água e moléculas protéicas temos: interação água - proteína e interação proteína-proteína. Nesse caso, podemos afirmar com certeza que o primeiro tipo de interação prevalecerá sobre o segundo porque a água possui grande capacidade de separação das partículas do soluto (constante dielétrica elevada).
Para os solventes orgânicos a situação é um pouco diferente... Como esse tipo de solvente apresenta valor de constante dielétrica bem inferior à da água, a interação proteína-proteína "vence" o poder de solvatação da água (interação água-proteína). A proteína precipita.
      A precipitação por solventes orgânicos depende muito da temperatura. Os solventes orgânicos, quando utilizados a temperaturas baixas, são bastante úteis na separação de misturas de proteínas. A temperaturas mais elevadas esses solventes podem levar à desnaturação por rompimento das pontes de hidrogênio e estabelecimento de interações apolares, importantes na manutenção da conformação protéica.

      c.1. Material

       c.2. Procedimento

      OBS: trabalhar a baixa temperatura

1. Tome dois tubos de ensaio e coloque, em cada um, 2 ml da solução de proteínas;       2. adicionar 4 ml de etanol gelado a cada tubo;       3. agite;       4. em um dos tubos, coloque uma pequena quantidade de NaCl sólido, sob agitação;       5. observe e responda: qual o efeito do álcool sobre a proteína na presença e na ausência do eletrólito?       6. Adicione 6 ml de água destilada e observe.       7. Repita as etapas anteriores substituindo o etanol pela acetona;       8. compare os resultados.

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