Extração e caracterização de enzimas

Antes de iniciar essa prática, algumas leituras são sugeridas:

Introdução às proteínas

Enzimas

1. Objetivos

          - estudar a natureza das enzimas
          - reconhecer as principais características das enzimas
          - conhecer a maneira através da qual é possível determinar qualitativamente a atividade enzimática

2. Introdução

          As reações enzimáticas são muito importantes em alimentos, podendo ser tanto benéficas, quanto prejudiciais. O amaciamento da carne, promovido pela enzima bromelina do abacaxi, e o aroma da cebola, proporcionado pela alinase, são bons exemplos de efeitos interessantes dessas macromoléculas. A mesma coisa não pode ser dita quando tratamos do escurecimento de frutas como banana ou maçã, quando expostas ao ar. Esse escurecimento enzimático é causado pela polifenoloxidase e também pode ser observado na batata e outros vegetais de cor clara.
          As enzimas catalase e peroxidase também são exemplos de enzimas de grande interesse na área de alimentos. Elas ocorrem em plantas, animais e microrganismos. Nos animais e vegetais, acredita-se que a função delas é proteger os tecidos contra os efeitos tóxicos da água oxigenada (H2O2) formada durante o metabolismo celular, uma vez que aceleram a decomposição dessa substância em H2O e O2. A diferença entre elas está no mecanismo de ação. Enquanto a catalase reduz diretamente a água oxigenada a água e gás oxigênio, a peroxidase o faz acelerando a reação da água oxigenada com um substrato específico,por exemplo,o guaiacol, formando um composto marrom escuro. Os esquemas abaixo representam essas reações:

 

3. Procedimento experimental

          3.1. Preparo do extrato enzimático

          1. Lave e descasque uma maçã de tamanho médio;
          2. triture no liquidificador com 250 mL de água destilada;
          3. filtre, através de uma gaze, e armazene o filtrado.

 
Você observou como o suco da maçã escureceu com o passar do tempo? Sabe por que??
                    Além das enzimas catalase e peroxidase, a maçã, assim como a banana e a batata, possui a enzima polifenoloxidase, responsável pelo escurecimento de frutos e vegetais depois de cortado e expostos ao ar. A esse processo dá-se o nome de escurecimento enzimático. O mecanismo através do qual  essa enzima atua baseia-se na oxidação de compostos difenólicos (que possuem dois radicais hidroxila, -OH, ligado ao anel benzênico) e monofenólicos (que possuem um único radical hidroxila, -OH, ligado ao anel benzênico) presentes nas frutas e nos vegetais. A ação mais comum é sobre os difenóis, dentre os quais destaca-se o catecol , cuja oxidação está representada na figura abaixo:

          3.2. Caracterização das enzimas

          3.2.1. Reação do biureto: as enzimas têm natureza protéica?

          1. Prepare a seguinte bateria de tubos de ensaio, identificando-os:

          (1) cinco gotas do filtrado acima (solução enzimática) + 2 mL de água destilada
          (2) 2 mL de água destilada

          2. agite e adicione 2 mL do reagente de biureto em cada um dos tubos;
          3. misture e compare os resultados.

         3.2.2. Teste da atividade das enzimas

          A. TESTE PARA CATALASE

          1. Prepare a seguinte bateria de tubos de ensaio: (1) 5 gotas de água oxigenada 10V, (2) 5  mL do           filtrado enzimático + 5 gotas de água oxigenada 10V;
          2. tampando a boca dos tubos, misture os conteúdos por inversão, sem agitar;
          3. deixe em repouso por alguns minutos;
          4. observe e explique os resultados.

           Como você explicaria a diferença de comportamento dos conteúdo dos tubos 1 e 2?

           B. TESTE PARA PEROXIDASE

           1. Numere dois tubos de ensaio e transfira 2 mL do filtrado de maçã + 2 mL de água destilada para            cada um deles;                      
           2. aos dois tubos, adicione 1 mL da solução de guaiacol 0,5%;
           3. coloque, apenas no tubo 1, 5 gotas de água oxigenada 10V;
           4. agite;
           5. observe as alterações ocorridas durante um período de aproximadamente 3 minutos;
           6. anote os resultados.

 
 
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